第十一章 動(dòng)物基因工程

第十一章動(dòng)物基因工程河南科技大學(xué)1

第一節(jié)基因工程概述

理論上的三大發(fā)現(xiàn)DNA為遺傳物質(zhì)：Avery的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)和DNA半保留復(fù)制機(jī)制遺傳密碼與中心法則河南科技大學(xué)2技術(shù)上的三大發(fā)明

1.限制性內(nèi)切酶和連接酶：DNA的“手術(shù)刀”與“縫紉機(jī)”

2.載體：運(yùn)送遺傳物質(zhì)的工具，如質(zhì)粒、病毒等

3.逆轉(zhuǎn)錄酶：從mRNA到DNA，使真核基因制備成為可能

河南科技大學(xué)3河南科技大學(xué)4河南科技大學(xué)5河南科技大學(xué)6河南科技大學(xué)7河南科技大學(xué)8河南科技大學(xué)9河南科技大學(xué)10河南科技大學(xué)113、基因工程的內(nèi)容目的基因的獲得目的基因與載體的連接成重組DNA分子重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞篩選重組克隆基因表達(dá)與產(chǎn)物分離河南科技大學(xué)12基因操作中的工具酶手術(shù)刀－限制性核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶縫紉機(jī)－連接酶復(fù)印機(jī)－DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶第二節(jié)基因操作中的工具酶河南科技大學(xué)13第三節(jié)基因工程的載體

將外源DNA或基因攜帶入宿主細(xì)胞（hostcell）的工具稱為載體。一、基因工程載體的概念：河南科技大學(xué)14二、基因工程載體的分類：

基因工程載體決定了外源基因的復(fù)制、擴(kuò)增、傳代乃至表達(dá)。目前已構(gòu)建應(yīng)用的基因工程載體主要有質(zhì)粒載體噬菌體載體病毒載體人工構(gòu)建的組合載體河南科技大學(xué)15一、細(xì)菌質(zhì)粒載體質(zhì)粒介紹：

質(zhì)粒(plasmid)是能自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA分子，它們?cè)诩?xì)菌中以獨(dú)立于染色體之外的方式存在，一個(gè)質(zhì)粒就是一個(gè)DNA分子，其大小可從1kb到300kb。質(zhì)粒廣泛存在于細(xì)菌之中，在某些藍(lán)藻、綠藻和真菌細(xì)胞中也存在質(zhì)粒。質(zhì)粒DNA的特點(diǎn)為：（1）雙鏈環(huán)狀；（2）分子量很??；（3）自主或半自主復(fù)制；（4）不同生物質(zhì)粒中的基因種類不同。河南科技大學(xué)16二、質(zhì)粒載體的種類

（一）克隆載體

克隆載體主要用于擴(kuò)增或保存DNA片段，是最簡(jiǎn)單的載體。

克隆載體必須具備的基本條件：具有復(fù)制起點(diǎn)具有抗菌素抗性基因具有若干個(gè)限制酶單一識(shí)別位點(diǎn)具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)河南科技大學(xué)17噬菌體

噬菌體內(nèi)含雙鏈環(huán)形、單鏈環(huán)形、雙鏈線形、單鏈線形等多種形式、大小不一的DNA，最常見(jiàn)的是雙鏈線形DNA,且感染率高。0.02-0.3

m二、噬菌體(Bacterophage)載體河南科技大學(xué)18

噬菌體×275,000,Scanningelectronmicroscopy河南科技大學(xué)19基因工程的主要目的是通過(guò)優(yōu)良性狀相關(guān)基因的重組，獲得具有高度應(yīng)用價(jià)值的新物種。為此，須從現(xiàn)有生物群體中，根據(jù)需要分離出可用于克隆的此類基因。這樣的基因通常稱之為目的基因。目的基因主要是結(jié)構(gòu)基因。目的基因：

純度很高片斷大小適于重組操作

第四節(jié)獲得真核生物目的基因的方法河南科技大學(xué)20目的基因的獲得方法分離化學(xué)合成

河南科技大學(xué)21一、利用PCR法獲取目的基因PCR:polymerasechainreaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是80年代發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)，是通過(guò)模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的方式，在體外選擇性地將DNA某個(gè)特殊區(qū)域擴(kuò)增出來(lái)的技術(shù)。

摘要：

其過(guò)程與DNA復(fù)制一樣有三個(gè)步驟：模板變性，引物與模板復(fù)性，延伸。河南科技大學(xué)222、PCR擴(kuò)增，主要的是引物設(shè)計(jì)，引物設(shè)計(jì)需要遵循一定的原則。3、用于PCR的DNA聚合酶種類很多，性質(zhì)各異，可以滿足不同的實(shí)驗(yàn)需要。4、PCR技術(shù)應(yīng)用廣泛，可以通過(guò)A/T克隆、UDG克隆等方法介導(dǎo)克隆，還可以通過(guò)同源重組、重疊延伸等方法介導(dǎo)定點(diǎn)誘變。反向PCR，反轉(zhuǎn)錄PCR在基因操作中也扮演了重要角色。PCR技術(shù)還廣泛應(yīng)用于鑒定、診斷等領(lǐng)域。河南科技大學(xué)23（一）

PCR的基本原理

1．基本要素和擴(kuò)增原理

基本要素與DNA復(fù)制的基本要素是一致的。待拷貝的DNA稱為模板，它可以是雙鏈DNA也可是單鏈DNA，最后擴(kuò)增得到的產(chǎn)物是雙鏈狀態(tài)的。引物是DNA復(fù)制的先鋒，就象結(jié)晶過(guò)程中的晶核，引導(dǎo)DNA的合成。在PCR擴(kuò)增中一般使用合成的寡核苷酸作引物。DNA聚合酶是DNA復(fù)制的動(dòng)力，在dNTP等底物存在時(shí)在引物的引導(dǎo)下沿著模板DNA合成互補(bǔ)的DNA鏈。河南科技大學(xué)242．PCR擴(kuò)增的步驟

首先將模板DNA置于92℃-96℃，進(jìn)行變性（denaturation）處理，使dsDNA在高溫下解鏈成為ssDNA，且熱變性不改變其化學(xué)性質(zhì)；然后退火（annealing），將溫度降至37℃-72℃，使引物與模板的互補(bǔ)區(qū)相結(jié)合；最后，在72℃條件下，DNA聚合酶將dNTP連續(xù)加到引物的3'-OH端，合成DNA，這個(gè)步驟稱為延伸（extension）。這三個(gè)熱反應(yīng)過(guò)程的重復(fù)稱為一個(gè)循環(huán)，經(jīng)過(guò)20-40個(gè)循環(huán)可擴(kuò)增得到大量位于兩條引物之間序列的DNA片段。河南科技大學(xué)25河南科技大學(xué)26PCR河南科技大學(xué)27PCR：變性－退火－延伸河南科技大學(xué)28（三）PCR反應(yīng)程序1．常規(guī)程序預(yù)變性

:94-96℃幾十秒至幾分鐘變性：94℃、30秒鐘退火：50-65℃、30秒鐘；25～35次循環(huán)延伸：72℃、1分鐘72℃保持3-7min4℃保存河南科技大學(xué)292．復(fù)性（退火）和延伸溫度

復(fù)性的溫度是PCR擴(kuò)增是否順利的關(guān)鍵因素，通常在50-60℃之間。具體的溫度主要由引物的Tm值決定。延伸溫度絕大多數(shù)設(shè)定為72℃。如果復(fù)性的溫度很高，可以將延伸溫度和復(fù)性溫度設(shè)置成同一溫度，變成二步法PCR。河南科技大學(xué)303．反應(yīng)時(shí)間

變性步驟一般使用30秒鐘，如果模板的G+C含量較高，或直接用細(xì)胞做模板，變性時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)。復(fù)性時(shí)間有30秒種一般是足夠的。延伸時(shí)間由擴(kuò)增產(chǎn)物的大小決定，一般采用1kb用1分鐘來(lái)保證充足的時(shí)間。河南科技大學(xué)314．循環(huán)次數(shù)

循環(huán)次數(shù)主要與模板的起始數(shù)量有關(guān)，在模板拷貝數(shù)為104～105數(shù)量級(jí)時(shí)，循環(huán)數(shù)通常為25～35次。平臺(tái)效應(yīng)（plateaueffect）：PCR擴(kuò)增過(guò)程后期會(huì)出現(xiàn)的產(chǎn)物的積累按減弱的指數(shù)速率增長(zhǎng)的現(xiàn)象。原因：底物和引物的濃度已經(jīng)降低，dNTP和DNA聚合酶的穩(wěn)定性或活性降低，產(chǎn)生的焦磷酸會(huì)出現(xiàn)末端產(chǎn)物抑制作用，非特異性產(chǎn)物或引物的二聚體出現(xiàn)非特異性競(jìng)爭(zhēng)作用，擴(kuò)增產(chǎn)物自身復(fù)性，高濃度擴(kuò)增產(chǎn)物變性不徹底。

河南科技大學(xué)32（五）循環(huán)條件的設(shè)定1、變性2、退火3、延伸4、循環(huán)次數(shù)河南科技大學(xué)33（六）引物設(shè)計(jì)原則通用原則：1、引物長(zhǎng)度：15－30Nt為宜2、引物堿基盡可能隨機(jī)分布3、引物內(nèi)部不應(yīng)自身形成二級(jí)結(jié)構(gòu)4、兩個(gè)引物之間不能形成互補(bǔ)結(jié)構(gòu)5、引物3’末端與模板配對(duì)河南科技大學(xué)34RT-PCR河南科技大學(xué)35第七節(jié)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)（Transgenictechnology）河南科技大學(xué)36

轉(zhuǎn)基因與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物速生長(zhǎng)效應(yīng)的“轉(zhuǎn)基因超級(jí)鼠”。轉(zhuǎn)基因鼠比與