維生素的測定課件

1、第十章 維生素的測定第1頁，共49頁。10.1概述 維生素是維持機體正常生理功能及細胞內(nèi)特異代謝反應所必需的一類微量低分子天然有機化合物。 雖然各類維生素的化學結(jié)構(gòu)不同，生理功能各異、但它們都具有以下共同特點：它們都是以其本體的形式或可被機體利用的前體形式存在于天然食物中；大多數(shù)維生素不能在體內(nèi)合成，也不能大量儲存于組織，所以必須經(jīng)常由食物供給；它們不是構(gòu)成各種組織的原料，也不提供能量；雖然每日生理需要量(僅以mg或ug計)很少，然而在調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝過程中卻起著十分重要的作用。維生素常以輔酶或輔基的形式參與酶的功能；不少維生素具有幾種結(jié)構(gòu)相近、生物活性相同的化合物。第2頁，共49頁。二、命名第3

2、頁，共49頁。三、分類 根據(jù)維生索的溶解性可將其分成兩大類： 1脂溶性維生素 包括維生素A、D、E、K，它們不溶于水而溶于脂肪及有機溶劑(如苯、乙醚及氯仿等)中；在食物中它們常與脂類共存，在酸敗的脂肪中容易破壞；其吸收與腸道中的脂類密切相關；主要儲存干肝臟中； 2水溶性維生素 包括B族維生素（維生素B1、B2、PP、B6、葉酸、B12，泛酸、生物素等）和維生素C。與脂溶性維生素不同，水溶性維生素及其代謝產(chǎn)物較易排出，體內(nèi)沒有非功能性的單純的儲存形式。 有些化合物，其活性類似維生素，曾被列入維生素類，通常稱之為“類維生素”，如生物類黃酮、輔酶Q、肌醇、硫辛酸、對氨基苯甲酸、乳清酸和?；撬岬?。第4

3、頁，共49頁。四、測定意義食品科學研究者需要準確的食品成分分析信息，計算營養(yǎng)素的膳食攝入，以改善人類的營養(yǎng)；食品營養(yǎng)價值評價；食品生產(chǎn)工藝設計及強化食品的評價；食品資源開發(fā)；食品標簽的準確性。五、測定方法涉及人體和動物的生物分析方法；利用原生生物、細菌和酵母等的微生物分析方法；化學法、分光光度法、熒光法、色譜、酶法、免疫和放射等物理化學分析方法。第5頁，共49頁。10.2 脂溶性維生素的測定脂溶性維生素的理化性質(zhì)：溶解性：不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、苯、乙醚等有機溶劑。耐酸堿性：VA、VD對酸不穩(wěn)定，對堿穩(wěn)定； VE對酸穩(wěn)定，對堿不穩(wěn)定。耐熱性：VA、VD、VE耐熱性好，能經(jīng)受煮沸

4、耐氧化性：VA易被氧化，光、熱促進氧化 VE易被氧化，光、熱、堿促進氧化 VD性質(zhì)穩(wěn)定，不易氧化第6頁，共49頁。一、維生素A的測定 維生素A類是指含有-白芷酮環(huán)的多烯基結(jié)構(gòu)、并具有視黃醇生物活性的一大類物質(zhì)。廣義而言包括已經(jīng)形成的維生素A和維生素A原。動物體內(nèi)具有視黃醇生物活性功能的維生素A類包括視黃醇、視黃醛、視黃酸等物質(zhì)，4-氧視黃酸、4-羥視黃酸等不具有視黃醇生物活性功能。維生素A分為維生素A1和維生素A2，A1主要存在于海產(chǎn)魚中，A2主要存在于淡水魚中。在植物中不含已形成的維生素A，在黃、綠、紅色植物中含有類胡蘿卜素，其中一部分可在體內(nèi)轉(zhuǎn)變成維生紊A的類胡蘿卜素稱為維生素A原，如-胡

5、蘿卜素、-l胡蘿卜素、-胡蘿卜素等。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的類胡蘿卜素約600種，僅有約1/10為維生素A原。第7頁，共49頁。維生素A 的功能：維持正常視覺維持上皮的正常生長與分化促進生長發(fā)育抑癌作用維持機體正常免疫功能供給量與來源：1989年RDA中成人每人每天攝入維生素800ug視黃醇當量。1992年全國營養(yǎng)調(diào)查表明，我國城鄉(xiāng)居民視黃醇當量平均攝入量僅為476ug，其中約23來自植物性食物。維生素A最好的來源是各種動物肝臟、魚肝油、魚卵、全奶、奶油、禽蛋等；維生素A原的良好來源是深色蔬菜和水果，如冬寒菜、菠菜、首宿、空心萊、萵筍葉、芹菜葉、胡蘿卜、豌豆苗、紅心紅薯、椒及水果中的芒果、杏子及柿子等。

6、第8頁，共49頁。（一）三氯化銻比色法1 原理 維生素A在三氯甲烷中與三氯化銻相互作用，生成藍色物質(zhì)，其顏色深淺與溶液中所含維生素A的含量成正比。 該藍色物質(zhì)不穩(wěn)定，需在一定時間內(nèi)（6秒）用分光光度計于620nm波長處測定其吸光度。2 試劑 無水乙醚、無水乙醇、三氯甲烷等試劑需預先處理。 維生素A標準溶液3 操作步驟維生素A極易被光破壞，實驗操作應在微弱光線下進行，或用棕色玻璃儀器。第9頁，共49頁。3.1樣品處理：根據(jù)樣品性質(zhì)，可采用皂化法或研磨法。 3.1.1皂化法：適用于維生素A含量不高的樣品，可減少脂溶性物質(zhì)的干擾，但全部試驗過程費時，且易導致維生素A損失。皂化：根據(jù)樣品中維生素A含量

7、的不同，稱取0.55g樣品于三角瓶中，加入10mL 1:1氫氧化鉀及2040mL乙醇，于電熱板上回流30min至皂化完全為止。 提?。合礈欤簼饪s：第10頁，共49頁。水層皂化瓶內(nèi)混合物分液漏斗1號水洗乙醚洗振搖，靜置，分層水層醚層分液漏斗2號振搖，靜置，分層醚層水層分液漏斗3號振搖，靜置，分層醚層分液漏斗1號提取第11頁，共49頁。振搖，靜置，分層分液漏斗1號水洗醚層水層KOH溶液洗振搖，靜置，分層醚層KOH溶液層水洗振搖，靜置，分層醚層水層振搖，靜置，分層水洗醚層水層凈化第12頁，共49頁。分液漏斗醚層乙醚洗滌水浴蒸餾減壓抽干氯仿定容（5mL)無水硫酸鈉濃縮第13頁，共49頁。3.1.2研磨

8、法：適用于每克樣品維生素A含量大于510g樣品的測定，如肝的分析。（步驟簡單，省時，結(jié)果準確。）研磨：精確稱25g樣品，放入盛有35倍樣品重量的無水硫酸鈉研缽中，研磨至樣品中水分完全被吸收，并均質(zhì)化。提?。盒⌒牡貙⑷烤|(zhì)化樣品移入帶蓋的三角瓶內(nèi)，準確加入50100mL乙醚。緊壓蓋子，用力振搖2min，使樣品中維生素A溶于乙醚中。使其自行澄清(大約需12h)，或離心澄清(因乙醚易揮發(fā)，氣溫高時應在冷水浴中操作。裝乙醚的試劑瓶也應事先放入冷水浴中)濃縮：取澄清提取乙醚液25mL，放入比色管中，在7080水浴上抽氣蒸干。立即加入1mL三氯甲烷溶解殘渣。第14頁，共49頁。3.2 標準曲線制備 準確

9、取一定量的維生素A標準液于45個容量瓶中，以三氯甲烷配制標準系列。 取相同數(shù)量比色管順次取1mL三氯甲烷和標準系列使用液1mL，各管加入乙酸酐1滴，制成標準比色系列。 于620nm波長處，以三氯甲烷調(diào)節(jié)吸光度至零點，將其標準比色系列按順序移入光路前，迅速加入9mL三氯化銻三氯甲烷溶液。于6s內(nèi)測定吸光度。 以吸光度為縱坐標，以維生素A含量為橫坐標繪制標準曲線圖。第15頁，共49頁。3.3 樣品測定于一比色管中加入10mL三氯甲烷，加入1滴乙酸酐為空白液。 另一比色管中加入1mL三氯甲烷，其余比色管中分別加入1mL樣品溶液及1滴乙酸酐。 其余步驟同標準曲線的制備。4 結(jié)果計算 第16頁，共49頁

10、。（二）HPLC法（GB/T 12388）1.原理樣品中的維生素A及維生素E經(jīng)皂化提取處理后，將其從不可皂化部分提取至有機溶劑中。用高效液相色譜法C18反相柱將維生素A和維生素E分離，經(jīng)紫外檢測器檢測，并用內(nèi)標法定量測定。 最小檢出量分別為VA：0.8ng；E：91.8ng；E：36.6ng；E：20.6ng。第17頁，共49頁。2 試劑 無水乙醚、無水乙醇、三氯甲烷等試劑需預先處理。 維生素A標準溶液、維生素E標準溶液 內(nèi)標物溶液：10g苯并e芘 /mL3 儀器和設備高壓液相色譜儀帶紫外分光檢測器。 第18頁，共49頁。4.操作步驟4.1樣品處理4.1.1皂化稱取110g樣品(含維生素A約3

11、g，維生素E各異構(gòu)體約為40g)于皂化瓶中，加30mL無水乙醇，進行攪拌，直到顆粒物分散均勻為止。加5mL 10%抗壞血酸，苯并e芘標準液2.00mL，混勻。加10mL1:1氫氧化鉀，混勻。于沸水浴上回流30min使皂化完全。皂化后立即放入冰水中冷卻。第19頁，共49頁。4.1.2提取 將皂化后的樣品移入分液漏斗中，用50mL水分23次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用約100mL乙醚分兩次洗皂化瓶及其殘渣，乙醚液并入分液漏斗中。如有殘渣，可將此液通過有少許脫脂棉的漏斗濾入分液漏斗。輕輕振搖分液漏斗2min，靜置分層，棄去水層。4.1.3洗滌 用約50mL水洗分液漏斗中的乙醚層，用pH試紙檢驗直

12、至水層不顯堿性(最初水洗輕搖，逐次振搖強度可增加)。第20頁，共49頁。4.1.4濃縮 將乙醚提取液經(jīng)過無水硫酸鈉(約5g)濾入與旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器配套的250300mL球形蒸發(fā)瓶內(nèi)，用約10mL乙醚沖洗分液漏斗及無水硫酸鈉3次，并入蒸發(fā)瓶內(nèi)，并將其接至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，于55水浴中減壓蒸餾并回收乙醚，待瓶中剩下約2mL乙醚時，取下蒸發(fā)瓶，立即用氮氣吹掉乙醚。立即加入2.00mL乙醇，充分混合，溶解提取物。 將乙醇液移入一小塑料離心管中，離心5min(5000rpm)。上清液供色譜分析。如果樣品中維生素含量過少，可用氮氣將乙醇液吹干后，再用乙醇重新定容。并記下體積比。 第21頁，共49頁。4.2高效液相色

13、譜分析條件（推薦條件）預柱：ultrasphere ODS 10m，4mm4.5cm。分析柱：ultrasphere ODS 5m，4.6mm25cm。流動相：甲醇水982?；靹?。于臨用前脫氣。紫外檢測器波長：300nm。量程0.02。進樣量：20L。流速：1.7mL/min。第22頁，共49頁。4.3標準曲線的制備4.3.1維生素A和維生素E標準濃度的標定方法取維生素A和各維生素E標準液若干微升，分別稀釋至3.00mL乙醇中，并分別按給定波長測定各維生素的吸光值。用比吸光系數(shù)計算出該維生素的濃度。 標準加入標準的量S,ul比吸光系數(shù)，Ecm1%波長，,nm視黃醇（VA）10.00183532

14、5-生育酚100.071294-生育酚100.092.8298-生育酚100.091.2298第23頁，共49頁。4.3.2標準曲線的制備（采用內(nèi)標法） 把一定量的維生素A、生育酚、生育酚、生育酚及內(nèi)標苯并e芘液混合均勻。 進樣，色譜分析。 以維生素峰面積與內(nèi)標物峰面積之比為縱坐標，維生素濃度為橫坐標繪制維生素標準曲線，或計算直線回歸方程。 本方法不能將E和E分開，E峰中包含有E峰。 第24頁，共49頁。4.4樣品分析取樣品濃縮液20L，待繪制出色譜圖及色譜參數(shù)后，再進行定性和定量。4.4.1定性：用標準物色譜峰的保留時間定性。4.4.2定量：根據(jù)色譜圖求出某種維生素峰面積與內(nèi)標物峰面積的比值

15、，以此值在標準曲線上查到其含量?；蛴没貧w方程求出其含量。5計算式中：X2某種維生素的含量，mg/100g；C由標準曲線上查到某種維生素含量，g/mL；V樣品濃縮定容體積，mL；m樣品質(zhì)量， g。第25頁，共49頁。二、胡蘿卜素的測定 胡蘿卜素是一種廣泛存在于有色蔬菜和水果中的天然色素，有多種異構(gòu)體和衍生物，總稱為類胡蘿卜素，其中在分子結(jié)構(gòu)中含有-紫羅寧殘基的類胡蘿卜素，在人體內(nèi)可轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素A，故稱為維生素A原。如、胡蘿卜素，其中-胡蘿卜素效價最高，每mg -胡蘿卜素約相當于167ug維生素A。第26頁，共49頁。胡蘿卜素的性質(zhì)： 胡蘿卜素對熱及酸、堿比較穩(wěn)定，紫外線和空氣中的氧可促進其氧化破

16、壞。胡蘿卜素易溶于有機試劑，可用有機溶劑從食物中提取。胡蘿卜素含有共軛雙鍵數(shù)目較多，本身是一種色素，在450nm波長處有最大吸收。測定方法：薄層色譜、紙色譜、HPLC國家標準中采用紙色譜法進行測定（GB/T 123891990） 1. 測定原理 以丙酮和石油醚提取食物中的胡蘿卜素及其他植物色素；以石油醚為展開劑進行紙層析，將胡蘿卜素與與其他色素分離；剪下含胡蘿卜素的區(qū)帶，洗脫后于450nm波長下定量測定。第27頁，共49頁。2 操作方法（1）樣品處理糧食：樣品用水洗三次，置60烤箱中烤干，磨粉，儲于塑料瓶內(nèi)，放一小包樟腦精，蓋緊瓶塞保存，備用。蔬菜與其他植物性食物：取可食部用水沖洗三次后，用紗

17、布吸去水滴，切碎，用勻漿器制成勻漿，貯于塑料瓶內(nèi)，冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。?）提?。ㄐ璞芄鈼l件下進行）取適量樣品（相當于含胡蘿卜素約2080g）置于100mL帶塞錐形瓶中加入丙酮20mL，石油醚5mL，振搖1min，靜置5min將提取液轉(zhuǎn)入盛有100mL 5%硫酸鈉溶液的分液漏斗中于錐形瓶中加入10mL丙酮石油醚混合液，振搖1min，靜置5min，將提取液并入分液漏斗中。重復提取23次，直至提取液無色為止。第28頁，共49頁。植物油和高脂肪樣品：需先皂化，取適量樣品(10g)，加脫醛乙醇30mL，再加10mL 1:1氫氧化鉀溶液，回流加熱30min，然后用冰水使之迅速冷卻，皂化后樣品用石油醚提取，直

18、至提取液無色為止。 （3）洗滌提取液靜置分層，棄去下層水溶液；反復用5%硫酸鈉溶液振搖洗滌，直至下層水溶液清亮為止。將皂化后樣品提取液用水洗滌至中性。石油醚提取液通過盛有10g無水硫酸鈉的小漏斗，漏入球形瓶，用少量石油醚分數(shù)次洗凈分液漏斗和無水硫酸鈉層內(nèi)的色素，洗滌液并入球形瓶內(nèi)。（4）濃縮與定容提取液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)（60），蒸發(fā)至約1mL時，取下，氮氣吹干，立即加入2.00mL石油醚定容，備層析用。第29頁，共49頁。（5）紙層析點樣：在18cm30cm濾紙下端距底邊4cm處作一基線，在基線上取A、B、C、D四點，吸取0.1000.400mL濃縮液(6.3)在AB和CD間迅速點樣。展

19、開：待紙上所點樣液自然揮發(fā)干后，將濾紙卷成圓筒狀，置于預先用石油醚飽和的層析缸中，進行上行展開。洗脫：待胡蘿卜素與其他色素完全分開后，取出濾紙，自然揮發(fā)干石油醚，剪下位于展開劑前沿的胡蘿卜素層析帶，立即放入盛有5mL石油醚的具塞試管中，用力振搖，使胡蘿卜素完全溶入溶劑中。第30頁，共49頁。（6）比色測定用1cm比色杯，以石油醚調(diào)節(jié)零點，于450nm波長下，測吸光度，以其值從標準曲線上查出胡蘿卜素的含量，供計算時使用。標準曲線繪制（7）標準曲線制備 取胡蘿卜素標準使用液(濃度為50g/mL)1.00、2.00、3.00、4.00、6.00、8.00mL，分別置于100mL具塞錐形瓶中，按樣品測

20、定步驟進行操作，點樣體積為0.100mL，標準曲線各點胡蘿卜素含量依次為2.50、5.00、7.50、10.00、15.00、20.00g。以胡蘿卜素含量為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線。 （8）結(jié)果計算第31頁，共49頁。三、維生素E的測定 維生素E又稱生育酚，屬于酚類化合物。目前已經(jīng)確認的有四種異構(gòu)體：、生育酚和、三烯生育酚。維生素E的測定方法有：比色法、熒光法、HPLC法等第32頁，共49頁。熒光法 1原理 樣品經(jīng)皂化、提取、濃縮蒸干后，用正己烷溶解不皂化物。在295nm激發(fā)波長，324nm發(fā)射波長下測定其熒光強度，并與標準-維生素E作比較，從而計算出樣品中維生素E的含量。2 操作

21、方法（1）樣品處理 稱樣皂化瓶維生素C無水乙醇KOH溶液水分液漏斗乙醚分離水層乙醚層第33頁，共49頁。醚層經(jīng)無水硫酸鈉過濾，氮氣流真空蒸干正已烷溶解，定容。（2）熒光測定激發(fā)波長：295nm 發(fā)射波長：324nm激發(fā)狹縫：3nm 發(fā)射狹縫：2nm樣品及標準溶液分別置于1cm比色杯，測定熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，讀取最大激發(fā)波長及最大發(fā)射波長下的熒光強度F（3）結(jié)果計算第34頁，共49頁。10.3 水溶性維生素的測定 水溶性維生素B1、B2和C，廣泛存在于動植物組織中，飲食來源充足。性質(zhì)：溶解性：水溶性維生素都易溶于水，而不溶于苯、乙 醚、氯仿等大多數(shù)有機溶劑。穩(wěn)定性：在酸性介質(zhì)穩(wěn)定，既使加熱也

22、不破壞； 但在堿性介質(zhì)中不穩(wěn)定，易于分解，特別在 堿性條件下加熱，可大部或全部破壞。 易受空氣、光、熱、酶、金屬離子等的影響， 維生素B2對光，特別是紫外線敏感，易被光 線破壞 維生素C對氧、銅離子敏感，易被氧化。第35頁，共49頁。食品中水溶性維生素的測定食品中維生素B1的測定食品中維生素B2的測定食品中維生素C的測定食品中煙酸的測定食品中維生素B6的測定第36頁，共49頁。一、維生素B1的測定維生素B1又稱硫胺素、抗神經(jīng)炎素。測定方法：比色法 熒光法（GB/T 12390-1990） HPLC法1. 熒光法原理第37頁，共49頁。 硫胺素在堿性鐵氰化鉀溶液中被氧化成噻嘧色素，在紫外線下，噻

23、嘧色素發(fā)出熒光。在給定的條件下，以及沒有其他熒光物質(zhì)干擾時，此熒光之強度與噻嘧色素量成正比，即與溶液中硫胺素量成正比。 本方法適用于各類食物中硫胺素的測定，但不適用于有吸附硫胺素能力的物質(zhì)和含有影響噻嘧色素熒光物質(zhì)的樣品。本方法的最小檢出限為0.05g。 第38頁，共49頁。2. 主要試劑活性人造浮石硫胺素標準溶液3. 儀器設備熒光分光光度計Maizel-Gerson 反應瓶鹽基交換管第39頁，共49頁。3. 操作步驟（1）試樣處理 樣品勻漿（或粉碎）于低溫冰箱中冷凍保存。（2）提取水解 酶解稱樣三角瓶高壓水解鹽酸溶液調(diào)pH值乙酸鈉溶液酶解淀粉酶定容第40頁，共49頁。（3）凈化樣品熱水酸性氯化鉀收集酸性氯化鉀定容至25ml第41頁，共49頁。（4）氧化 靜置 過濾 脫水反應瓶編號標準A瓶標準B瓶樣品A瓶樣品B瓶加標準液或樣品液標準液5ml標準液5ml樣品液5ml樣品液5ml加氫氧化鈉3ml3ml加堿性鐵氰化鉀3ml3ml加正丁醇10ml10ml10ml10ml第42頁，共49頁。（5）熒光強度測定激發(fā)波長365nm；