微生物的純種分離與培養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo)

微生物的純種分離與培養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo)

微生物的純種分離及培養(yǎng)技術(shù)

實(shí)驗(yàn)2-1土壤中細(xì)菌、放線菌、酵母 菌及霉菌的分離與純化實(shí)驗(yàn)2-2化能自養(yǎng)微生物的分離與純化實(shí)驗(yàn)2-3從沼液中分離產(chǎn)甲烷細(xì)菌微生物的純種分離與培養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)2-1土壤中細(xì)菌、放線菌、酵母菌

及霉菌的分離與純化一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.學(xué)習(xí)、掌握從土壤稀釋分離、劃線分離各類微生物的技術(shù)。

2.學(xué)習(xí)從樣品中分離、純化出所需菌株。

3.學(xué)習(xí)并掌握平板傾注法和斜面接種技術(shù)，了解培養(yǎng)細(xì)菌、放線菌、酵母菌及霉菌四大類微生物的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時(shí)間。

4.學(xué)習(xí)平板菌落計(jì)數(shù)法。微生物的純種分離與培養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)2-1土壤中細(xì)菌、放線菌、酵母菌

及霉菌的分離與純化二、實(shí)驗(yàn)原理將待分離的樣品進(jìn)行一定的稀釋，使微生物的細(xì)胞（或孢子）盡量呈分散狀態(tài)，選用有針對(duì)性的培養(yǎng)基，在不同溫度、通風(fēng)等條件下培養(yǎng)，讓其長成一個(gè)純種單個(gè)菌落。要想獲得某種微生物的純培養(yǎng)，還需提供有利于該微生物生長繁殖的最適培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。微生物四大類菌的分離培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間見表2-1所示。微生物的純種分離與培養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)2-1土壤中細(xì)菌、放線菌、酵母菌

及霉菌的分離與純化表2-1微生物四大類菌的分離和培養(yǎng)要求樣品來源分離對(duì)象分離方法稀釋度培養(yǎng)基名稱培養(yǎng)溫度/℃培養(yǎng)時(shí)間/d土樣細(xì)菌稀釋分離10-5，10-6，10-7牛肉膏蛋白胨30～371～2土樣放線菌稀釋分離10-3，10-4，10-5高氏1號(hào)285～7土樣霉菌稀釋分離10-2，10-3，10-4馬丁氏瓊脂28～303～5面肥或土樣酵母菌稀釋分離10-4，10-5，10-6馬鈴薯葡萄糖28～302～3細(xì)菌分離平板細(xì)菌單菌落劃線分離10-2牛肉膏蛋白胨30～371～2微生物的純種分離與培養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)2-1土壤中細(xì)菌、放線菌、酵母菌

及霉菌的分離與純化三、實(shí)驗(yàn)材料

1.菌源土樣

2.培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，馬丁氏培養(yǎng)基，高氏合成1號(hào)培養(yǎng)基，馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(制平板和斜面)，見附錄Ⅲ。

3.無菌水250mL錐形瓶，每瓶裝99mL無菌水(或95mL為分離霉菌用)，內(nèi)裝10粒玻璃珠。4.5mL無菌水試管(每人5～7支)。

4.其他物品無菌培養(yǎng)皿，無菌移液管，無菌玻璃涂棒(刮刀)，稱量紙，藥勺，橡皮頭，10%酚溶液。

微生物的純種分離與培養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)2-1土壤中細(xì)菌、放線菌、酵母菌

及霉菌的分離與純化（一）系列稀釋平板法

1.取土樣選定取樣點(diǎn)，按對(duì)角交叉（五點(diǎn)法）取樣。先除去表層約2cm的土壤，將鏟子插入土中數(shù)次，然后取2～10cm處的土壤。盛土的容器應(yīng)是無菌的。將5點(diǎn)樣品約1kg充分混勻，除去碎石、植物殘根等雜物，裝入已滅過菌的牛皮紙袋內(nèi)，封好袋口，并記錄取樣地點(diǎn)、環(huán)境及日期。同時(shí)取10～15g，稱重后經(jīng)105℃烘干8h，置干燥器中冷卻后再次稱重，計(jì)算含水量。土樣采集后應(yīng)及時(shí)分離，凡不能立即分離的樣品，應(yīng)保存在低溫、干燥條件下，盡量減少其中菌種的變化。微生物的純種分離與培養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)2-1土壤中細(xì)菌、放線菌、酵母菌

及霉菌的分離與純化

2.制備土壤稀釋液稱土樣1g于盛有99mL無菌水的三角瓶中，充分振蕩，此即為10-2濃度的菌懸液。用無菌移液管吸取懸液于無菌水試管中，用移液管吹吸三次，搖勻，此即為10-3濃度。同樣方法，依次稀釋到10-7。稀釋過程需在無菌室或無菌操作條件下進(jìn)行，稀釋過程見圖2-1。

微生物的純種分離與培養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)2-1土壤中細(xì)菌、放線菌、酵母菌

及霉菌的分離與純化圖2-1稀釋分離過程示意圖微生物的純種分離與培養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)2-1土壤中細(xì)菌、放線菌、酵母菌

及霉菌的分離與純化

3.接種分離不同的微生物類群采用不同的稀釋度，參考表2-1進(jìn)行選擇。從稀至濃分別吸取各濃度稀釋液1mL于各平皿中（每個(gè)稀釋度每種做2-3個(gè)培養(yǎng)皿，并注意做好濃度及培養(yǎng)基種類標(biāo)記），同時(shí)做空白對(duì)照，倒入熔化后冷卻至45℃～50℃左右的相應(yīng)培養(yǎng)基，見圖2-2，輕輕地?fù)u動(dòng)并旋轉(zhuǎn)平皿，使菌懸液與培養(yǎng)基混合均勻，水平靜置待凝，倒置于相應(yīng)溫度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～5天后，觀察菌落情況及計(jì)數(shù)。微生物的純種分離與培養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)2-1土壤中細(xì)菌、放線菌、酵母菌

及霉菌的分離與純化圖2-2稀釋分離無菌操作圖1.包裝紙?zhí)字腥〕鰺o菌移液管；2.安裝橡皮頭，勿用手指觸摸移液管；3.火焰旁取出土壤懸浮液；4.灼燒試管口及移液管吸液口；5.在火焰旁對(duì)試管中土壤懸浮液進(jìn)行稀釋；6.用手掌敲打試管，混勻土壤稀釋液；7.從最小稀釋度開始，將稀釋液加入無菌培養(yǎng)皿中；8.將融化冷涼至45～50℃培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿內(nèi)；9.用畢的移液管裝入廢棄物缸中浸泡消毒后滅菌洗滌微生物的純種分離與培養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)2-1土壤中細(xì)菌、放線菌、酵母菌

及霉菌的分離與純化

4.培養(yǎng)冷凝后，將平板倒置于在各自適宜的溫度下培養(yǎng)，培養(yǎng)一定時(shí)間后觀察。

5.計(jì)數(shù)選菌落單個(gè)分散、菌落數(shù)適量且各平行皿數(shù)量接近的稀釋度的平皿計(jì)數(shù)。通常細(xì)菌和放線菌選取菌落數(shù)在30～300之間的平皿，霉菌選菌落數(shù)在10～100之間的平皿，最后換算成每克干土所含菌數(shù)，記錄于表2-2。微生物的純種分離與培養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)2-1土壤中細(xì)菌、放線菌、酵母菌

及霉菌的分離與純化表2-2樣品中四大類微生物的菌落數(shù)稀釋度菌落數(shù)類別采樣日期采樣地點(diǎn)10-210-310-410-510-6平均每克樣品所含微生物數(shù)細(xì)菌放線菌酵母菌霉菌微生物的純種分離與培養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)2-1土壤中細(xì)菌、放線菌、酵母菌

及霉菌的分離與純化（二）涂布法分離（酵母菌定量分離用）依前法向無菌培養(yǎng)皿中傾倒已融化并冷卻至45～50℃的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，待平板冷凝后，用無菌移液管分別吸取三個(gè)不同稀釋度菌懸液，依次滴加于相應(yīng)編號(hào)已制備好的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基平板上，右手持無菌玻璃涂棒，左手拿培養(yǎng)皿，并用拇指將皿蓋打開一縫，在火焰旁右手持玻璃涂棒于培養(yǎng)皿平板表面將菌液自平板中央均勻向四周涂布擴(kuò)散，切忌用力過猛將菌液直接推向平板邊緣或?qū)⑴囵B(yǎng)基劃破(圖2-3)。微生物的純種分離與培養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)2-1土壤中細(xì)菌、放線菌、酵母菌

及霉菌的分離與純化圖2-3涂布操作示意圖微生物的純種分離與培養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)2-1土壤中細(xì)菌、放線菌、酵母菌

及霉菌的分離與純化（三）平板劃線法取各平板一只做好標(biāo)記，將接種環(huán)經(jīng)火焰滅菌并冷卻后，蘸一環(huán)10-2土壤稀釋液，按圖2-4和圖2-5的方式在培養(yǎng)基表面輕輕劃線，注意勿劃破瓊脂。劃線完畢，將培養(yǎng)基倒置培養(yǎng)，2～5天后，挑取單個(gè)菌落，并移植于斜面上培養(yǎng)。如果只有一種菌生長，即得純培養(yǎng)菌種。如有雜菌，可取培養(yǎng)物少許，制成懸液，再做劃線分離，有時(shí)要反復(fù)幾次，才能得到純種。微生物的純種分離與培養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)2-1土壤中細(xì)菌、放線菌、酵母菌

及霉菌的分離與純化圖2-4劃線分離圖

圖2-5劃線分離示意圖

微生物的純種分離與培養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)2-1土壤中細(xì)菌、放線菌、酵母菌

及霉菌的分離與純化（四）平板菌落形態(tài)及個(gè)體形態(tài)觀察從不同平板上選擇不同類型菌落觀察，區(qū)分細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌的菌落形態(tài)特征。再用接種環(huán)挑取不同菌落，在顯微鏡下進(jìn)行個(gè)體形態(tài)觀察。將所分離的各類菌株的主要菌落特征和細(xì)胞形態(tài)記錄于表2-3。（五）分離純化菌株轉(zhuǎn)接斜面（斜面接種）在分離細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌的不同平板上選擇分離效果較好的菌落各挑選一個(gè)用接種環(huán)接種斜面，見圖2-6。微生物的純種分離與培養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)2-1土壤中細(xì)菌、放線菌、酵母菌

及霉菌的分離與純化表2-3各類菌株的主要菌落特征和細(xì)胞形態(tài)

菌株編號(hào)分離培養(yǎng)基菌落特征細(xì)胞形態(tài)細(xì)菌12放線菌12酵母菌12霉菌12微生物的純種分離與培養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)2-1土壤中細(xì)菌、放線菌、酵母菌

及霉菌的分離與純化圖2-6斜面接種技術(shù)微生物的純種分離與培養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)2-1土壤中細(xì)菌、放線菌、酵母菌

及霉菌的分離與純化

將細(xì)菌接種于牛肉膏蛋白胨斜面，放線菌接種于高氏1號(hào)斜面，霉菌接種于馬丁氏培養(yǎng)基，酵母菌接種于馬鈴薯葡萄糖斜面上。貼好標(biāo)簽，在各自適宜的溫度下培養(yǎng)，培養(yǎng)后觀察是否為純種，記錄斜面培養(yǎng)條件及菌苔特征于表2-4。置冰箱保藏。微生物的純種分離與培養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)2-1土壤中細(xì)菌、放線菌、酵母菌

及霉菌的分離與純化表2-4四大類微生物斜面培養(yǎng)條件及菌苔特征微生物培養(yǎng)基名稱培養(yǎng)溫度培養(yǎng)時(shí)間菌苔特征純化程度細(xì)菌放線菌酵母菌霉菌微生物的純種分離與培養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)2-1土壤中細(xì)菌、放線菌、酵母菌

及霉菌的分離與純化五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1.簡(jiǎn)述分離微生物純種的原則及列出分離操作過程的關(guān)鍵無菌操作技術(shù)。

2.將所檢測(cè)樣品中四大類微生物的菌落數(shù)填入表2-2。

3.將所檢測(cè)樣品中各類菌株的主要菌落特征和細(xì)胞形態(tài)填入表2-3。

4.記錄斜面培養(yǎng)條件及菌苔特征（包括純化結(jié)果）于表2-4。返回微生物的純種分離與培養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)2-2化能自養(yǎng)微生物的分離與純化

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.學(xué)習(xí)土壤中采樣、富集培養(yǎng)、分離純化硝化細(xì)菌。

2.學(xué)習(xí)硅膠平板制備，了解培養(yǎng)硝化細(xì)菌的培養(yǎng)基制備和培養(yǎng)方法。二、實(shí)驗(yàn)原理硝化細(xì)菌是化能自養(yǎng)菌類群中主要類群之一。包括亞硝化細(xì)菌和硝化細(xì)菌(或稱亞硝酸氧化細(xì)菌)兩個(gè)亞群。培養(yǎng)硝化菌的溫度，因菌源而異，從中溫環(huán)境下分離的菌株，最適生長溫度為26～28℃，從高溫環(huán)境下分離的菌株，40℃下生長良好。微生物的純種分離與培養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)2-2化能自養(yǎng)微生物的分離與純化

三、實(shí)驗(yàn)材料

1.菌源土樣合成氨車間周圍和堆放合成氨場(chǎng)地周圍土樣。

2.培養(yǎng)基硝化細(xì)菌增殖培養(yǎng)基，硝化細(xì)菌分離培養(yǎng)基（見附錄Ⅲ），牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，馬丁培養(yǎng)基，馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基。

3.試劑格里斯氏試劑（亞硝酸鹽試劑），二苯胺－硫酸試劑（硝酸鹽試劑），見附錄Ⅲ。

4.其他物品無菌水，無菌培養(yǎng)皿，無菌移液管，無菌微口滴管，無菌玻璃涂棒，透析袋，比色板，培養(yǎng)箱等。

微生物的純種分離與培養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)2-2化能自養(yǎng)微生物的分離與純化

四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.采樣采集土樣，選合成氨車間和堆放合成氨場(chǎng)地周圍土樣。

2.富集培養(yǎng)稱取土樣1g，接入到盛有20mL硝化細(xì)菌增殖培養(yǎng)液的250mL錐形瓶中，28℃振蕩培養(yǎng)10～14d，每隔幾天在白磁板上分別加2～3滴格里斯氏試劑及二苯胺-硫酸試劑，然后用無菌滴管取出1滴增殖培養(yǎng)液的培養(yǎng)物加于上面兩試劑中，攪和均勻。檢查增殖培養(yǎng)液中NO2-的減少（溶液由紅色、粉紅色變?yōu)闊o色）和NO3-的形成（NO3-氧化二苯胺的特有反應(yīng)，溶液由無色變?yōu)樯钏{(lán)色）。微生物的純種分離與培養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)2-2化能自養(yǎng)微生物的分離與純化

3.分離純化取富集培養(yǎng)液，通CO2氣體30min，然后靜置30min，再通過硅膠平板分離法進(jìn)行分離純化。①制取硅膠平板取等體積的鹽酸(HCl比重1.09)和硅酸鈉(比重1.10)溶液，徐徐加入，緩慢混合，均勻攪拌，分裝于100～200mL透析袋中，蒸餾水中透析48h，其間換蒸餾水6～8次，待透析袋內(nèi)的硅酸鈉溶液無色透明后，高壓蒸汽滅菌或過濾除菌。吸取預(yù)先配制并已滅菌的硝化細(xì)菌分離培養(yǎng)基1mL、硅酸鈉溶液10mL于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，靜置片刻，待凝固后即可使用。微生物的純種分離與培養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)2-2化能自養(yǎng)微生物的分離與純化

②硅膠平板分離采用涂布分離法。取～富集培養(yǎng)液滴于5～10個(gè)硝化細(xì)菌分離培養(yǎng)基硅膠平板上，涂布分離。然后將硅膠平板放在盛有少量水的干燥器里(防止水分蒸發(fā)，避免硅膠平板干裂)，于28℃恒溫下培養(yǎng)3～4周，當(dāng)硅膠平板上出現(xiàn)硝化細(xì)菌極小的菌落后(多數(shù)菌落小于100μm)，挑取10～20個(gè)單菌落，分別接種到硝化細(xì)菌增殖培養(yǎng)液中，28℃恒溫下培養(yǎng)3～4周，依前述方法檢驗(yàn)NO2-及NO3-。微生物的純種分離與培養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)2-2化能自養(yǎng)微生物的分離與純化

4.純度檢查硝化細(xì)菌培養(yǎng)過程常會(huì)有異養(yǎng)型細(xì)菌伴生，所以必須用多種有機(jī)營養(yǎng)培養(yǎng)基檢查培養(yǎng)物是否有異養(yǎng)菌污染。常用的有機(jī)營養(yǎng)培養(yǎng)基是：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基檢查異養(yǎng)型細(xì)菌，馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基檢查霉菌，馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基檢查酵母菌。

5.鏡檢對(duì)分離純化的硝化細(xì)菌進(jìn)行鏡檢及革蘭氏染色。常見的硝化細(xì)菌特征見表2-5所示。微生物的純種分離與培養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)2-2化能自養(yǎng)微生物的分離與純化

表2-5常見的硝化細(xì)菌屬細(xì)胞形態(tài)鞭毛革蘭氏染色結(jié)果硝化桿菌屬短桿狀、梨形或球形單鞭毛，通常不運(yùn)動(dòng)G-硝化球菌屬球形偏端鞭毛，運(yùn)動(dòng)G-硝化刺細(xì)菌屬細(xì)長直感狀、球形不運(yùn)動(dòng)G-微生物的純種分離與培養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)2-2化能自養(yǎng)微生物的分離與純化

五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1.記錄硝化細(xì)菌的分離方法及培養(yǎng)條件于下表2-6。

2.分離、純化硝化細(xì)菌菌株的記錄于表2-7。表2-6硝化細(xì)菌分離方法及培養(yǎng)條件

樣品來源分離方法稀釋度培養(yǎng)基名稱培養(yǎng)溫度培養(yǎng)條件微生物的純種分離與培養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)2-2化能自養(yǎng)微生物的分離與純化

表2-7分離、純化硝化細(xì)菌菌株的記錄菌株編號(hào)分離培養(yǎng)基菌落特征鏡檢結(jié)果返回微生物的純種分離與培養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)2-3厭氧菌的分離與培養(yǎng)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.了解厭氧微生物的生長特性；

2.觀察厭氧微生物（產(chǎn)甲烷菌）的形態(tài)特征；

3.掌握亨氏厭氧技術(shù)分離產(chǎn)甲烷細(xì)菌的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理本實(shí)驗(yàn)所使用的亨蓋特滾管技術(shù)，就是把適當(dāng)稀釋度的產(chǎn)甲烷細(xì)菌富集培養(yǎng)物，在無氧條件下接入含滅菌瓊脂培養(yǎng)基的厭氧試管中，然后將它在滾管機(jī)上或者冰盤中均勻滾動(dòng)，使含菌培養(yǎng)基均勻地凝固在試管內(nèi)壁上。微生物的純種分離與培養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)2-3厭氧菌的分離與培養(yǎng)

三、實(shí)驗(yàn)材料

1.菌源樣品沼液。

2.培養(yǎng)基產(chǎn)甲烷菌分離培養(yǎng)基（固體和液體）若干試管，培養(yǎng)基的配方見附錄Ⅴ。

3.滅菌的厭氧試劑硫化鈉(1%)+碳酸氫鈉(5%)混合試劑，％乙酸鈉，25%甲酸鈉，50%甲醇。

4.器材高純度的氮?dú)?，氫氣和二氧化碳，氧裝置一套，水浴鍋，無菌毛細(xì)管，試管架，滾管機(jī)，冰塊，lmL滅菌注射器若干，旋渦混合器l臺(tái)。微生物的純種分離與培養(yǎng)技術(shù)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)2-3厭氧菌的分離與培養(yǎng)

四、實(shí)驗(yàn)方法

1.富集培養(yǎng)在已滅菌的液體培養(yǎng)管中用lmL滅菌注射器加入1%硫化鈉和碳酸氫鈉混合試劑，加入青霉素液，加入乙酸鈉、甲酸鈉、甲醇各，然后接入分離物lg。置35℃下振蕩培養(yǎng)10～15d。

2.熔化好裝有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)管，排列在水溫為5